栀子提取物分离纯化工艺研究

崔龙 胡少银 刘和平

[摘要] 目的 优选栀子提取物的分离纯化工艺参数。 方法 以西红花总苷转移率和色价为综合评分指标，通过单因素试验和正交试验设计优选栀子提取物的最佳分离纯化工艺参数，并进行工业化生产验证。 结果 最佳分离纯化工艺为：提取液以0.5 mg/mL的浓度上HPD-100A树脂吸附，依次用12 BV纯化水、2 BV的35%乙醇以1 BV/h的流速洗脱除杂，再以同样的流速用4 BV的65%乙醇洗脱即得栀子提取物。最佳工艺条件下进行中试生产验证，3批栀子提取物的西红花总苷转移率、色价和产率均值分别为86.25%、509.82和2.11%，其RSD值分别为1.56%、0.39%和2.33%。 结论 该栀子提取物分离纯化工艺经过工业化生产验证，稳定、可靠。

[关键词] 栀子;栀子提取物;西红花苷;柱层析

[中图分类号] R286.0          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（a）-0033-05

梔子提取物是重要的药物合成原料及中间体，其制剂血脉清片具有降血脂、抗动脉粥样硬化以及抗肿瘤等作用[1-3]，临床上常用于治疗高脂血症[4-5]。栀子提取物是以茜草科植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的果实为原料，经提取、精制而成的橙红色至暗棕红色的粉末，主要含有西红花苷、西红花酸，还有少量环烯醚萜苷类的栀子苷及黄酮、绿原酸等化学成分[6];其水溶液在紫外-可见光区440 nm处有特征吸收峰[7]。目前，栀子提取物的制备工艺研究鲜有报道，而食品添加剂栀子黄的分离纯化研究报道较多，主要有溶剂提取法、萃取技术、膜分离技术、柱层析纯化等多种制备方法[8]，但仅有柱层析法普遍应用于工业化生产。

栀子提取物和栀子黄的主要区别在于西红花总苷和西红花苷-Ⅰ的含量。栀子黄中西红花总苷含量与色价呈良好的正相关，且当栀子黄的色价>500时，即符合栀子提取物的质量要求。本研究以栀子为研究对象，以西红花总苷转移率、色价为评价指标，用大孔吸附树脂HPD-100A对栀子提取液进行吸附，然后通过水、不同浓度的乙醇溶液解吸附，以期达到分离纯化栀子提取物的目的。

1 仪器与试药

1.1 仪器

MS205DU电子分析天平（梅特勒-托利多，0.01/0.1 mg）;UV-2450紫外可见分光光度计[岛津（中国）有限公司];N-3010旋转蒸发仪[埃朗科技国际贸易（上海）有限公司];CS101-2EBN电热恒温鼓风干燥箱（重庆四达实验仪器有限公司）;不锈钢提取罐（陕西宏达实业有限公司）;HWZ系列单效外循环真空浓缩器（陕西宏达实业有限公司）;MCSZZ-20000不锈钢树脂柱（浙江明辰机械科技有限公司）;1500-IS振荡筛（南京宝威干燥机械设备厂）;FZG低温真空干燥烘箱（南京禄旺干燥设备有限公司）。

1.2 试药

西红花苷-Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111588-201303）;HPD-100A大孔吸附树脂购自沧州宝恩吸附材料有限公司;乙醇为药用级，购自中山市华士达化工有限公司;其余试剂均为分析纯。

栀子果实（鲜栀子干燥品破碎成4～5 mm的颗粒），购自安徽郎溪县奕龙栀子种植专业合作社，经国家中药现代化工程技术中心曹晖教授鉴定为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥果实。

2 方法与结果

2.1 西红花总苷含量及色价的测定

按照陈阳等[9-11]报道的方法测定栀子提取液或提取物的西红花总苷含量及色价。

2.1.1 对照品溶液的制备  精密称定西红花苷-Ⅰ对照品6.11 mg，置10 mL量瓶中，加50%乙醇溶液溶解、定容，即得西红花苷-Ⅰ为0.5658 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备  取栀子提取液或提取物适量，置200 mL量瓶中，加50%乙醇溶液定容至刻度，摇匀即得（若测定吸光度值不在0.3～0.7，则重新制备）。

2.1.3 测定法  精密吸取西红花苷-Ⅰ对照品溶液适量，加50%乙醇溶液适量，定容，制成浓度分别为2.8289、3.5362、5.6579、7.0723、14.1447、28.2893 μg/mL的对照品溶液。以50%乙醇溶液为空白对照，测定对照品溶液在440 nm处的吸光度值（A），以A为纵坐标，西红花苷-Ⅰ浓度为横坐标，计算回归方程。回归方程为Y = 101.3800X+0.00591（r = 0.9999），西红花苷-Ⅰ在2.8289～28.2893 μg/mL范围线性关系良好。照上述方法，以50%乙醇溶液为空白对照，测定供试品溶液的西红花总苷浓度，计算西红花总苷含量及其转移率。

2.1.4 色价  以2.1.3项下测得的供试品溶液在440 nm处的吸光度值计算色价。色价=A×f/（100 m），其中A：供试品溶液在440 nm处的吸光度值;f：稀释倍数;m：试样质量（提取液以总固物计）。

2.2 HPLC测定西红花苷-Ⅰ含量

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验  栀子提取液及提取物中西红花苷-Ⅰ按照刘和平等[12-14]报道的方法测定。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以甲醇-水（60∶40）为流动相，进样量：5 μL;流速：1.0 mL/min;柱温：25℃;检测波长：440 nm。西红花苷-Ⅰ的分离度>1.5，理论板数以西红花苷-Ⅰ计≥2000。见图1。

2.2.2 溶液制备  对照品溶液制备：精密称取西红花苷-Ⅰ对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL中含西红花苷-Ⅰ 80 μg的溶液，精密量取3 mL，至100 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。供试品溶液制备：取栀子提取物10 mg，精密称定，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声处理15 min，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1 mL，置20 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 西红花苷-Ⅰ的标准曲线  分别精密量取浓度为86.77 μg/mL对照品溶液10、5 μL，浓度为8.677 μg/mL对照品溶液10、5、2.5 μL，以及浓度为0.8677 μg/mL对照品溶液20、10、5 μL，注入液相色谱仪中，按“2.2.1”色谱条件测定。以峰面积（Y）为纵坐标，以西红花苷-Ⅰ对照品的量（X）为横坐标，绘制标准曲线，得线性方程Y = 20.122X-172.73，R2 = 0.9997。结果表明，西红花苷-Ⅰ在4.3385～867.7 ng浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度  取“2.2.2”项下的西红花苷-Ⅰ对照品溶液、供试品溶液，按上述“2.2.1”项下色谱条件，分别连续进样6次，记录西红花苷-Ⅰ的峰面积。其峰面积的RSD值分别为0.87%、0.56%，表明该方法精密度良好。

2.2.5 稳定性  取栀子提取物及西红花苷-Ⅰ对照品，分别按“2.2.2”项下方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于0、1、3、6、12、24、48 h测定，记录西红花苷-Ⅰ的峰面积。其峰面积的RSD值分别为1.12%、1.54%，表明供试品溶液及对照品溶液在48 h内基本稳定。

2.2.6 重复性  取栀子提取物，平行6份，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录西红花苷-Ⅰ的峰面积。西红花苷-Ⅰ的含量的RSD值为1.89%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率  取西红花苷-Ⅰ对照品，精密称取50.325 mg，置于20 mL容量瓶中，加甲醇并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。另取已知含量的供试品，精密称取9份，每份10 mg，平均分成3组，分别精密加入上述“2.2.2”项下对照品溶液1、2、3 mL，按上述“2.2.2”项下方法处理后进样测定，计算西红花苷-Ⅰ的含量、加样回收率、RSD值。结果平均回收率为98.48%，RSD为1.62%。见表1。

2.2.8 样品含量测定  取3批栀子提取物样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法，分别制成供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。

2.3 提取物提取浓缩、上样液的制备

取已破碎的栀子干果，依次用6、4、4倍量的50%乙醇溶液在50℃水浴中浸提3次，每次2 h，每隔30 min搅拌1次。合并3次提取液，过300目筛网，即得栀子提取液，提取液经减压浓缩（≤70℃）至无醇味，再用纯化水稀释至1.0 g/mL（以生药量计），备用。照2.1项下的方法测定提取液中西红花总苷含量和色价分别为11.5 mg/mL和61.25。

2.4 提取物柱层析分离纯化

2.4.1 树脂的选择及其预处理  HPD-100A樹脂是沧州宝恩吸附材料科技有限公司开发的专门用于生产栀子提取物的非极性大孔吸附树脂。根据既往对D101、D138、D3520、X-5、NKA-9、AB-8、HPD-400等多种树脂的对比研究[15-20]，发现HPD-100A树脂对栀子提取物有很好的吸附性和选择性，故选择HPD-100A大孔吸附树脂。根据使用说明书，其预处理方法为：用95%乙醇浸泡树脂24 h，取适量，装柱，然后用5 BV的95%乙醇以2 BV/h的流速洗脱，最后用纯化水以同样的流速冲洗至无醇味，备用。

2.4.2 动态吸附曲线的绘制及上样量的确定  取栀子提取液，以1 mL/min的流速上样于已处理好的50 mL的HPD-100A树脂，分段收集流出液（每段2.5 mL为1份），依次编号，共13份。照“2.1”项下测定流出液中的西红花总苷的含量。流出液11中西红花总苷含量明显增加，故最佳生药吸附量为0.25 g/mL（以树脂体积计算）。见图2。

2.4.3 提取物柱层析分离纯化参数考察  取经预处理好的HPD-100A大孔吸附树脂，湿法装柱（柱径高比1∶3、1∶5、1∶7），取不同浓度（1、0.5、0.33 g/mL）的栀子提取液以0.5 BV/h的流速上柱吸附。然后依次用12 BV纯化水、2 BV低浓度乙醇（15%、25%、35%）和4 BV的65%乙醇洗脱，洗脱流速为1.0 BV/h，65%乙醇洗脱液即为栀子提取液。分别照2.1项下的方法测定栀子提取液中西红花总苷含量及色价，计算西红花总苷转移率。①固定上样浓度为1.0 g/mL、低浓度乙醇浓度为35%，与1∶5、1∶7比较，柱径高比为1∶3时西红花总苷的转移率和色价明显偏低。②固定上样浓度为1.0 g/mL、柱径高比1∶5，随着洗脱的低浓度乙醇浓度的增加，西红花总苷的转移率和色价逐渐升高，同时西红花总苷的损失也逐渐增加。③固定低浓度乙醇浓度为35%、柱径高比1∶5，在试验范围内，上样浓度对西红花总苷转移率和色价的影响不大。综合上述结果，选择35%乙醇洗脱除杂，上样浓度0.5 g/mL，柱径高比1∶5分离纯化栀子提取物。见表2。

2.4.4 提取物柱层析分离纯化正交试验  根据单因素试验结果，以西红花总苷转移率和色价为评价指标，以乙醇浓度、洗脱流速、洗脱量为考察因素设计正交表L9（34），优选栀子提取物分离纯化的工艺参数。本研究以西红花总苷转移率、色价两个指标综合评分，权重分别为50%和50%。正交试验设计表及试验结果见表3～4。由表4可知，对栀子提取物分离纯化的影响大小顺序为：A>B>C，即乙醇浓度影响最大;方差分析结果表明，各因素3个水平间差异无统计学意义（P < 0.05）。故优选的最佳纯化工艺参数组合为A3B1C2，即乙醇浓度65%、洗脱流速1.0 BV/h、洗脱量4 BV。

2.4.5 提取物柱层析分离纯化验证  按照优选的工艺参数在实验室进行了3批栀子提取物分离纯化放大试验。3批验证试验西红花总苷转移率、色价和产率（以浸出物含量计算）均值分别为90.89%、506.99和2.37%，其RSD值分别为2.13%、0.25%和1.93%，说明纯化工艺稳定、可靠。见表5。

2.5 栀子提取物分离纯化中试生产

为验证上述栀子提取物纯化工艺参数的稳定性与可靠性，在最佳纯化工艺参数条件下，进行了3批中试生产验证。3批栀子提取物纯化中试生产验证的西红花苷总转移率、色价和产率均值分别为86.25%、509.82和2.11%，其RSD值分别为1.56%、0.39%和2.33%，说明该工艺合理可行，适合工业化大生产。见表6。

2.6 栀子提取物中西红花总苷和西红花苷-Ⅰ的含量测定

按照“2.1”“2.2”项下测定3批中试样品中西红花总苷和西红花苷-Ⅰ的含量。3批栀子提取物中西红花总苷含量均>50%，西红花苷-Ⅰ的含量均>25%，符合原料药栀子提取物的质量标准的规定。见表7。

3 讨论

宋伟等[15]采用HPD-100A大孔吸附树脂分离纯化栀子黄色素，其提取液的色价从34.6升高到384.6，该研究采用水提取的栀子黄色素提取液的色价明显较低。涂华等[21]利用AB-8、HPD-100A、D101等5种大孔吸附树脂分离纯化栀子黄色素，其提取物的色价高达489，但该研究采用的微波辅助提取法目前难以实现工业化大生产。本研究以新鲜栀子干果为材料，采用合理的试验设计优选了栀子提取物的分离纯化方法，具体工艺参数：栀子提取液经减压浓缩至质量浓度为0.5 g/mL的药液，上HPD-100A大孔树脂柱（柱径比1∶5）吸附，生药吸附量0.25 g/mL（以树脂体积计算），然后以1.0 BV/h的洗脱流速依次用12 BV纯化水、2 BV的35%乙醇洗脱除杂，再用65%乙醇洗脱，即得栀子提取液;经减压浓缩、干燥、粉碎，即得栀子提取物（色价>500、产率=2.11%）。该工艺经3批中试生产验证，稳定、可靠，适合工业化大生产。

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2019-05-07